El exacto análisis de la mutación en 54 pacientes de Gaucher ingleses e irlandeses


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La Unidad Willink en el Hospital para niños Royal Manchester ha provisto de un servicio de diagnóstico para la enfermedad de Gaucher y para otras enfermedades de almacen lysosomal desde 1974. Durante este periodo han sido identificados 90 pacientes con la enfermedad de Gaucher. El Dr Ed Wraith, director de la unidad, es un especialista en pediatría con un interés especial en enfermedades de almacen lysosomal y esta a cargo de la Clínica de Gaucher, que le fueron otorgados unos fondos especiales a principios de año por el Departamento de la Salud. Lorraine Burnett es la enfermera de especialidad clínica responsable de los pacientes en tratamiento con Cerezyme. El Dr Alan Cooper es el bioquímico principal relacionado con estas enfermedades desde que el servicio de diagnóstico fue iniciado y describe en este artículo algo de su trabajo más reciente siguiendo a su discurso en el EWGGD en Maastricht el 3 de Mayo de 1997. Claire Hatton y Wendy Savage son las responsables de los análisis moleculares y bioquímicos.

La enfermedad de Gaucher es un trastorno de almacen lysosomal que resulta en la acumulación del lípido glucocerebroside dentro de las células. La acumulación es debida a la deficiencia de la enzima glucocerebrosidase la que normalmente descompone este compuesto.
La medida de esta enzima en los glóbulos blancos de la sangre, bajo condiciones controladas cuidadosamente permite hacer el diagnóstico de la enfermedad de Gaucher Tipo 1, 2 o 3. Se debe de enfatizar que se necesita una experiencia considerable para realizar e interpretar con precisión los resultados de estos ensayos (tests).

Hasta hace poco, los tres tipos de la enfermedad de Gaucher solo se podian diferenciar por observación clínica. En los últimos años, han sido inventadas técnicas biológicas moleculares que permiten a un laboratorio como el nuestro el identificar las mutaciones exactas que causan la enfermedad en los pacientes.

Hay una correlación relativamente buena entre el genotipo (mutaciones) y el fenotipo (severidad de la enfermedad) aunque esta correlación no es absoluta como discutiremos más tarde. De este modo si es conocido el genotipo, es posible predecir el resultado de la enfermedad hasta en un bebe.

Códigos genéticos
La situación del gen de la enfermedad de Gaucher es conocida y el gen como todos los demás ests formado por 4 bases (A, T, G y C) unidos por un extremo al otro. El gen porta el código necesario para hacer la enzima glucocerebrosidase.

Especifíca que aminoácidos deben de ser incluidos y en que punto. Las bases estan agrupadas de tres en tres (codons): esto provee de suficientes códigos únicos para todos los aminoácidos utilizados para hacer las proteínas enzimáticas. Por ejemplo el codon CCC es el código para el aminoácido Prolina asi como el codon AGT es el código para el aminoácido Serina.

Los errores que ocurren dentro del código del glucocerebrosidase (mutaciones) son los responsables de la enfermedad de Gaucher. Hoy en dia hay laboratorios en todo el mundo que tienen la habilidad de hacer pruebas para las mutaciones en los pacientes de Gaucher. La técnica más común utilizada se llama análisis de la restricción de la digestión.

Una enzima restricción corta el ADN cuando se encuentra con una secuencia específica de bases. Por ejemplo la enzima restricción Nci I cortará una hebra de ADN cuando se encuentra con una secuencia de CCGGG mientras que la enzima restricción Xho I lo cortará con la secuencia CTCGAG.

Asi como las mutaciones generalmente substituyen una base por otra, por ej. una T por una G, las mutaciones a menudo o destruyen el sitio donde la enzima de restricción corta la secuencia normal ( para que no se pueda ver) o crean un lugar nuevo para la enzima de restricción, el cual no está presente en la secuencia sin mutación.

Por ejemplo, una de las mutaciones más comunes en la enfermedad de Gaucher llamada L444P cambia la secuencia normal de las bases CCTGG a CCGGG (la base T es substituida por la G). Como ya sabemos, la enzima de restricción Nci I corta el ADN en la secuencia CCGGG.

De este modo creando millones de copias de una porción del gen del glucocerebrosidase donde ocurre la mutación, utilizando una técnica llamada de amplificación enzimática (PCR) y entonces digeriendo el ADN amplificado con Nci I, la mutación L444P puede ser rápidamente identificada. El ADN el cual contiene la secuencia mutada CCGGG es cortada en dos pequeños fragmentos mientras que la secuencia normal que no contiene la mutación permanece sin cortar, como se puede ver en la ilustración más abajo:

1                    2                   3

1  El gen normal sin cortar por la enzima.
2  Portador de L444P, medio ADN cortado en dos fragmentos y medio sin cortar.
3 Homocigoto (los dos genes) para el L444P, Todo el ADN cortado en dos fragmentos más pequeños.

Como son nombradas las mutaciones
Las mutaciones punta (donde una base es substituida por otra) son a menudo representadas por un número y dos letras. El número es la posición del aminoácido en la enzima glucocerebrosidase la cual es cambiada, la letra que precede el número representa el aminoácido en la proteína normal de la enzima mientras que la letra que sigue al número representa al aminoácido que es substituido provocado por la mutación.

Por ejemplo la mutación L444P cambia el aminoácido cuatrocientos cuarenta y cuatro de la Leucina (L) a una Prolina (P). Donde se inserta una base en el gen es indicado por el nùmero de la base que precede la inserción; por ej. 84G indica que la G ha sido insertada después de de la base ochenta y cuatro del gen. (Esta mutación ha sido llamada también 84GG).

Donde han sido borradas las bases del gen, son representadas por el número de la primera base borrada seguida por el número de bases borradas. ej. 1263Del 55 representa que se han borrado cincuenta y cinco bases empezando en la base del gen mil doscientos sesenta y tres.

El pseudo-gen
Existe una copia casi exacta del gen glucocerebrosidase, es conocida como el pseudo-gen. No tiene una función conocida y de este modo esta libre de mutar sin ningún efecto detrimental. Esto cuenta por el número de mutaciones punta presentes en la secuencia del pseudo-gen que no estan el el gen del glucocerebrosidase.

En ocasiones el ADN se cambia entre el gen del glucocerebrosidase y el del pseudo-gen, esto es conocido como recombinación. Esta recombinación puede resultar en la incorporación de bastantes mutaciones en el gen activo glucocerebrosidase. Ahí los alelos recombinantes (Rec) pueden resultar en la enfermedad de Gaucher.

Análisis de la mutación
Tres mutaciones han sido descritas cono comunes en varios países y más notablemente en los Estados Unidos. Estas mutaciones son N370S, L444P y 84G. Hemos encontrado que en UK la mutación R463C es común también y bastantes más mutaciones han aparecido frecuentemente de lo que son descritos en otros lugares.

Por esto en nuestro laboratorio el ADN de los pacientes de Gaucher es analizado por diez conocidas mutaciones, 84G, N370S, L444P, R463C, R496H, IVS2+1, D409H, RecNciI, RecTL y 1263Del 55.

Las mutaciones punta son inicialmente detectadas por el análisis de restricción digestiva, mientras que las mutaciones recombinantes y la deleción son detectadas haciendo la secuencia y el PCR respectivamente. Las mutaciones punta identificadas son más analizadas haciendo la secuencia y un número de anomalias han sido detectadas.

Las anomalias detectadas
Dos pacientes pensaban que portaban la mutación R463C utilizando la restricción de digestión se demostró subsecuentemente que tenian la mutación R463Q y una nueva mutación punta N462K. Siete pacientes que aparentemente eran portadores de la mutación L444P se mostró que actualmente tenian la mutación recombinante RecNci I. Esta mutación aparece por el intercambio del ADN entre los genes funcionales y los pseudo genes. La mutación L444P ocurre naturalmente en el pseudo-gen y es transferida al gen funcional glucocerebrosidase mediante el intercambio del ADN. De cualquier manera en los alelos RecNci, dos mutaciones más que ocurren naturalmente en el pseudo-gen A456P y V460V son transferidos tambien al gen funcional.

Fueron identificados con esta técnica dos nuevos alelos RecA456P y c1263Del 55+RecTL. Este último apareció homocigoto al L444P por la restricción digestión. Un paciente pensó que era homocigoto al R463C pero más tarde se demostró, mediante PCR, que portaba una copia del 55 de deleción base 1263Del 55.

Cuando una o más de las mutaciones permanece sin conocer, el ADN de los pacientes es analizado más extensamente mediante la secuencia de la región codificada del gen glucocerebrosidase. Hasta la fecha solo hemos analizado seis de los once exons (regiones codificadas). Han sido identificadas varias raras o únicas mutaciones.

Correlación entre el Genotipo y el Fenotipo
Genotipo         Adulto 1  Niño 1  Tipo 2   Tipo 3
N370S/N370S              4             0           0            0
N370S/L444P               4             0           0            0
N370S/RecNci I           4             0           0            0
N370S/L105R               1            0           0            0
N370S/R120W             1            0           0            0
N370S/?                        4            0          0            0
N370S/R463Q              0            1          0            0
N370S/RecA456P        0            1           0           0
L444P/R463C               2            1           0           0
L444P/?                        2            1          7            1
L444P/L444P               0            2           1            6
L444P/1263Del
              55+RecTL     0              0          1            0
R463C/R463C            1              0          0            0
R463C/RecNci I         0              3          0            0
R463C/IVS2+1           0              1          0            0
R463C/D409H           0               1          0           0
R463C/1263Del 55    0               1          0           0
1263Del 55/?              0               0         1           0
N462K/?                     0               0         1           0
?/?                               0              0          1           0
TOTAL                     23              12        12          7

Como se puede ver en la tabla anterior, hay una correlación relativamente buena entre las mutaciones portadas por un paciente y el curso clínico de la enfermedad en dicho paciente.

Enfermedad leve
Los pacientes con dos copias de la mutación N370S invariablemente tienen un relativo grado de la enfermedad leve. La presencia de una copia de la mutación N370S excluye los Tipos 2 y 3 de la enfermedad. Solo dos pacientes con una copia de esta mutación tuvieron un comienzo en la infancia de la enfermedad y esto probablemente demuestra la naturaleza severa de la segunda mutación.

Hemos identificado por primera vez la mutación R463C en su estado homocigoto. Esta mutación ahora puede ser clasificada como una mutación relativamente leve ya que el paciente homocigoto tiene un principio adulto de la enfermedad Tipo 1. Además todos los demás pacientes con una copia de esta mutación tienen un principio de la enfermedad Tipo 1 en la infancia portando mutaciones severas como su segundo alelo (gen).

La enfermedad más grave
La situación es menos clara con la mutación L444P. La mayoria de los pacientes con dos copias de esta mutación desarrollan la enfermedad Tipo 3. Sin embargo un paciente presentó una forma grave de la enfermedad Tipo 2 y dos pacientes desarrollaron el principio de la enfermedad Tipo 1 en la infancia. El más mayor de estos pacientes tiene ahora 30 años y esta confinado en una silla de ruedas con enfermedad grave en los huesos. Ella no ha mostrado todavia evidencia de implicación del sístema central nervioso. En un centro pediátrico como el nuestro, esta aparente falta de correlación entre el genotipo y el fenotipo para la mutación L444P no es problemática. Los pacientes homocigotos para esta mutación siempre se presentan en la infancia con una enfermedad relativamente grave a pesar de si el sístema central nervioso esta relacionado o no. Nosotros empezariamos siempre a pacientes como esos con una dosis alta de tratamiento con Cerezyme a menos que haya una fuerte evidencia clínica de la enfermedad Tipo 2.

Conclusiones
Las mutaciones que dan por resultado la enfermedad de Gaucher ahora pueden ser identificadas inmediatamente con técnicas relativamente simples. Esta información es inestimable para hacer decisiones clínicas en la mejor forma de tratamiento para los pacientes y tambien para hacer algunas predicciones acerca la clínica a largo plazo de la enfermedad en los pacientes individualmente a una edad prematura.

La identificación de las mutaciones de la enfermedad de Gaucher provee del único método de identificar portadores dentro de una misma familia cuando es requerido. En teoria el análisis de la mutación puede ser utilizado para una diagnosis en el primer trimestre prenatal pero ofrece poco avance sobre el ensayo enzimático y probablemente será menos fidedigno.

El análisis de la mutación no debe de ser acometidos solo por el análisis de restricción de digestión pues esto ha mostrado el resultado en un significante número de genotipos incorrectos. Los resultados deben de ser confirmados haciendo una secuencia del ADN genómico.
El método de elección sería el tinte automático fluorescente terminador ciclo de secuencia. Esta técnica es rápida e invuelve muy poco más trabajo que el análisis enzimático de restricción una vez que es conocida la situación de la mutación.

En la unidad Willink estamos contentos de aceptar ejemplos para análisis de la mutación de centros a traves de todo UK. Si los resultados iniciales han sido obtenidos mediante el análisis de restricción, podremos confirmar estos resultados mediante secuencias. Tambiem recibimos regularmente ejemplos de Irlanda, India, Turquía, Taiwan, Arabia Saudita y de bastantes más países alrededor del mundo.

El análisis de las mutaciones es una herramienta muy poderosa la cual ha aumentado significativamente el conocimiento sobre la enfermedad de Gaucher. Si se hace correctamente provee de una información clínica valiosa para los dos, doctores y familias con esta condición.


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Origen: Noticias de Gaucher de noviembre de 1997

Traducido por Victoria Villar Casares

© Copyright Gauchers Association 1997